肌萎縮側(cè)索硬化（ amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種神經(jīng)退行性疾病，其特征是大腦皮層、腦干和脊髓中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元選擇性喪失。

“至今尚未有可及的有效藥物?！?/span>

超氧化物歧化酶（SOD1）突變是肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)最主要的原因之一，突變的SOD1通過毒性作用導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性，而修改突變的SOD1基因是治療與該基因突變相關(guān)的ALS患者的最佳方法。

由腺相關(guān)病毒(AAV)系統(tǒng)傳遞的規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列(CRISPR)/CRISPR-associated (Cas9)/sgRNA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)基因組編輯的強(qiáng)大工具。

Gene Therapy上刊登的《The deletion of mutant SOD1 via CRISPR/Cas9/sgRNA prolongs survival in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model》一文中測試了AAV-SaCas9-sgRNA系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因SOD1G93A小鼠中修飾突變體SOD1的能力。

SOD1-G93A模型小鼠(也稱為G93A-SOD1)具有人類SOD1的G93A突變體形式的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。突變的SOD1具有毒性，會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性，雜合子在人類中表現(xiàn)出與肌萎縮性側(cè)索硬化癥（ALS）類似的表型，可用于研究包括肌萎縮性側(cè)索硬化癥在內(nèi)的神經(jīng)肌肉疾病。

設(shè)計(jì)sgRNA，編輯活性篩選

設(shè)計(jì)5個(gè)靶向sgRNA，通過熒光素酶報(bào)告基因法篩選，并用Western Blot檢測蛋白水平，發(fā)現(xiàn)sgRNA1和sgRNA5的活性比其他sgRNAs更優(yōu)越。

圖1 體外和體內(nèi)中SOD1基因編輯的活性

評(píng)估ICV注射后sgRNA1和5對(duì)SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的治療效果差異

新生SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠注射AAV9-SaCas9-LacZ(對(duì)照)、AAV9-SaCas9-sgRNA1、AAV9-SaCas9-sgRNA5或AAV9-SaCas9-sgRNA1和AAV9-SaCas9-sgRNA5的混合物(1.2×1011vg/pup)。

延緩發(fā)病時(shí)間：與注射了AAV9-SaCas9-LacZ的對(duì)照組小鼠比較，注射了AAV9-SaCas9-sgRNA1、AAV9-SaCas9-sgRNA5的小鼠顯著延緩了發(fā)病時(shí)間，其中注射AAV9 SaCas9-sgRNA5的小鼠的結(jié)果最為顯著。

提高生存率：不同AAV9-SaCas9-sgRNAs處理的轉(zhuǎn)基因小鼠，特別是AAV9-SaCas9-sgRNA5相比對(duì)照AAV9-SaCas9-LacZ處理的小鼠存活率顯著提高(圖1G和表1)

此外，轉(zhuǎn)棒測試也表明AAV9-SaCas9-sgRNA5治療組的運(yùn)動(dòng)功能也有較好的保留(圖1H)。

值得注意的是，接受AAV9-SaCas9-sgRNA5治療的SOD1突變小鼠的生存期顯著延長，但這些小鼠從發(fā)病到死亡的時(shí)間比對(duì)照組短，為了排除SOD1拷貝數(shù)帶來的影響，研究團(tuán)隊(duì)分析SOD1拷貝數(shù)后，發(fā)現(xiàn)AAV9-sgRNAs處理組與對(duì)照組之間沒有差異(表1)。

表1 AAV9-SaCas9- sgRNAs和LacZ對(duì)小鼠拷貝數(shù)、性別、發(fā)病及壽命的影響輯的活性

行為表現(xiàn)測試治療效果

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)SOD1 sgRNAs在ALS小鼠模型中的治療作用，通過行為表現(xiàn)測試來證實(shí)治療的效果，即117天時(shí)后肢伸展的評(píng)估和115、125天時(shí)足印的評(píng)估。

對(duì)照組小鼠發(fā)病后表現(xiàn)為震顫、行走不平衡、后肢肌肉萎縮、體重減輕和呼氣困難，病情在~4周內(nèi)嚴(yán)重惡化。

后肢伸展評(píng)估：與對(duì)照組相比，AAV9-SaCas9-sgRNA1和AAV9-SaCas9-sgRNA5治療117 天時(shí)，拉伸寬度明顯改善(圖 2A,B)。

圖2 AAV9-SaCas9-sgRNAs (sg1、sg5或sg1+sg5)和AAV9-SaCas9-sgLacZ(LacZ)處理的SOD1G93A小鼠后肢拉伸評(píng)估。

足印評(píng)估：在小鼠115和125天分析兩個(gè)連續(xù)的后肢腳印之間的最長距離。AAV9-SaCas9-LacZ、AAV9-SaCas9-sgRNA1、AAV9-SaCas9-sgRNA5和sgRNA1 + sgRNA5處理小鼠115天的平均步長分別為3.2±0.7 cm、5.7±0.32 cm、5.98±0.29 cm和4.16±1.22 cm(圖3A、B)。

圖3 AAV9-SaCas9-sgRNAs (sg1、sg5或sg1+sg5)與對(duì)照AAV9-SaCas9sgLacZ(LacZ)處理SOD1G93A小鼠的行為分析

評(píng)估AAV9 SOD1 sgRNAs對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)作用

為了直接觀察AAV9-SOD1-sgRNA對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)作用，通過Neu N和IBA 1染色以及熒光顯微鏡觀察小鼠的神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞。

圖4A：與對(duì)照組相比，AAV9-SaCas9-sgRNA5保留了相當(dāng)數(shù)量的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)，但并沒有明顯改變IBA1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞的激活(如圖4 A)。

為了證實(shí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保存是由于SOD1 AAV9 sgRNA敲除了SOD1，分析治療后小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中SaCas9和SOD1的表達(dá)。

圖4B：在對(duì)照組小鼠的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中檢測到強(qiáng)突變體SOD1染色，但在AAV9-SaCas9-sgRNAs處理小鼠的SaCas9陽性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中觀察到非常弱的突變體SOD1染色。

因此，注射AAV9-SaCas9-sgRNA5的小鼠表現(xiàn)明顯優(yōu)于對(duì)照組小鼠。

圖4 1.2×1011vg/pup 劑量SOD1 sgRNAs給予運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)

高劑量AAV9-SaCas9-sgRNA5進(jìn)一步改善ALS動(dòng)物模型的表型

為了研究AAV9-SaCas9-sgRNA5是否能進(jìn)一步改善ALS動(dòng)物模型的表型，給SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠注射4×1011 vg 的AAV9-SaCas9-sgRNA5，其劑量比以往(1.2×1011 vg)高3.3倍。

中位生存期顯著提高：與AAV9-SaCas9-LacZ處理的對(duì)照組小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠的中位生存期顯著提高54.6%(圖5A)。

改善肌肉強(qiáng)度：通過對(duì)轉(zhuǎn)棒時(shí)的表現(xiàn)和重量的評(píng)價(jià)，判斷高劑量AAV9-SaCas9-sgRNA5明顯改善后肢的癱瘓和肌肉萎縮(圖5 B、C)。

恢復(fù)運(yùn)動(dòng)能力：在小鼠115天和125天時(shí)分別給予4×1011 vg劑量的AAV9-SaCas9-sgRNA5，發(fā)現(xiàn)小鼠恢復(fù)了的步幅和運(yùn)動(dòng)能力(圖5 D、E)。

圖5 AAV9-SaCas9-sgRNA5對(duì)SOD1G93A小鼠的治療效果。

保留運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元：90.9%的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元被保留(圖6 A-C)。

減少神經(jīng)炎癥：AAV9-SaCas9-sgRNA5處理小鼠后，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞明顯受到抑制，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的SOD1熒光強(qiáng)度明顯減弱(圖6 D、E)。

圖6 AAV9-SaCas9-sgRNA5(sg5)在較高劑量(4×1011 vg)下給予運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)。

降低肌肉萎縮：通過對(duì)脛前肌的H&E染色，與對(duì)照組相比，使用SaCas9-sgRNA5組出現(xiàn)的肌肉萎縮區(qū)域明顯減少(圖7)。

圖7 AAV9-SaCas9-sgRNA5治療小鼠脛前肌面積與對(duì)照組比較

2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了CRISPR-cas9基因編輯技術(shù)，該技術(shù)能以前所未有的精度來編輯基因組，因此基于AAV-SaCas9-sgRNA的基因編輯對(duì)于與SOD1突變相關(guān)的ALS患者是一種可行的潛在治療方法。